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溶液环境对百日咳疫苗分离纯化的影响

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生物工程学报
journals.im.ac.cn cjb@im.ac.cn

Chin J Biotech 2008, July 25; 24(7): 1279-1284 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 ? 2008 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved

技术与方法

溶液环境对百日咳疫苗分离纯化的影响
吴铁 1,2, 闭静秀 2, 黄永东 2,3, 张焱 2,3, 孙李靖 2,3, 孙春宝 1, 苏志国 2
1 北京科技大学土木与环境工程学院, 北京 100083 2 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室, 北京 100080 3 中国科学院研究生院, 北京 100049



要: 针对百日咳疫苗在低盐条件下不稳定, 容易聚集而导致层析过程收率低、分离度低的难题, 实验中选择脲作为

稳定剂来改善百日咳疫苗所处的溶液环境, 并采用离子交换层析和凝胶过滤层析进行百日咳疫苗的分离纯化, 通过 ELISA 抗原活性测定和还原性 SDS-PAGE 等方法研究了脲对百日咳疫苗分离纯化的影响。结果表明, 在流动相中加入 2 mol/L 脲作为稳定剂, 能显著提高离子交换层析和凝胶过滤层析中的 PT 和 FHA 活性回收率、 凝胶过滤层析的分离度、 PT 和 FHA 的纯度。这些结果对百日咳疫苗的分离纯化和层析工艺优化提供了重要的依据和参考。 关键词: 溶液环境, 脲, 百日咳疫苗, 百日咳毒素, 丝状血凝素

Effect of Solution Environment on the Purification of Pertussis Toxin
Tie Wu1, Jingxiu Bi2, Yongdong Huang2,3, Yan Zhang2,3, Lijing Sun2,3, Chunbao Sun1, and Zhiguo Su2
1 Civil & Environmental Engineering School, University of Science and Technology of Beijing, Beijing 100083, China 2 National Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China 3 Graduate School of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Abstract: The low recovery of pertussis toxin (PT) and the low resolving efficiency of chromatography, due to the instability of PT
in low salt condition, are the main challenges for its purification. We aplied 2 mol/L urea to prevent the aggregation and disassociation of PT during the purification by ion-exchange chromatography (IEC) and gel filtration chromatography (GFC). The effect of urea on the purification of PT was studied by ELISA assay and non-reduced SDS-PAGE. The activity recoveries of PT and filamentous hemagglutinin (FHA) in IEC and GFC, the resolution efficiency in GFC and the purities of PT and FHA were improved obviously by adding 2 mol/L urea in the mobile phase. The results highlight the potential application of urea in the acellular pertussis vaccine (APV) manufacture procedure. Keywords: solution environment, urea, pertussis vaccine, pertussis toxin (PT), filamentous hemagglutinin (FHA)

百 日 咳 是 由 鲍 特 氏 百 日 咳 杆 菌 (Bordetella pertussis)引起的具有高度传染性的急性呼吸道传染 病 。1940 年左右研制出来的全细胞百日咳疫苗
[1]

(Whole cell pertussis vaccine, WPV)是将灭活的百日 咳杆菌作为接种疫苗, 但是存在的弊端是其频繁发 生的副作用, 以及导致急性或慢性神经性疾病。这

Received: October 26, 2007; Accepted: November 21, 2007 Supported by: the National Natural Science Foundation of China (Nos. 20536050, 20576136 & 20636010). Corresponding author: Zhiguo Su. Tel: +86-10-62561817; Fax: +86-10-62562813; E-mail: zgsu@home.ipe.ac.cn 国家自然科学基金项目(Nos. 20536050, 20576136 & 20636010)资助。

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促使人们研制更加安全、高效的无细胞百日咳疫苗 (Acellular pertussis vaccine, APV)。20 世纪 70 年代 日本的 Sato 等人研制出了由纯化的百日咳杆菌抗原 PT 和 FHA 组成的无细胞百日咳疫苗, 证实了在婴 幼儿中有良好的安全性和免疫原性 。不同厂家生 产的 APV 组分差异较大, 但所有的无细胞百日咳疫 苗都包含了百日咳毒素(Pertussis toxin, PT)。不同组 分和比例的疫苗对接种人群的保护率差异很大, 每 种物质都有不同的生物活性, 在免疫过程中所起的 作用也不同, 导致无细胞混合组分百日咳疫苗对人 群的保护率难于控制, 因而有必要将各个组分特别 是最主要的抗原组分分别纯化出来, 明确各自的生 理特性之后, 再按照不同的配比组成新的能够有效 保护接种人群的新剂型疫苗。 从 20 世纪 80 年代起, 国内外研究机构就开始 进行无细胞百日咳疫苗单组分的纯化研究, 研究过 程中使用了密度梯度离心和各种层析方法, 并且几 乎都用到了亲和层析。密度梯度离心和亲和层析由 于成本高, 不太适用于工业化生产廉价的百日咳疫 苗。*几年有人尝试用离子交换、珍珠岩层析、羟 基磷灰石层析等方法, 大大降低了生产成本。 本文采用 CM 离子交换层析, 并辅以凝胶过滤 层析分离出了高纯度的单组分 PT 和 FHA, 但是整 个层析过程的疫苗活性回收率比较低。鉴于 PT 和 FHA 都是具有高疏水性的蛋白, 在低盐水溶液中不 稳定, 容易形成聚集体, 只能在高离子强度或者含 本研究利 有 2 mol/L 脲的环境下才可以稳定存在 [3]。 用脲具有稳定 PT 和 FHA 结构的特点, 在整个层析 过程中加入 2 mol/L 脲, 研究了脲对 PT 和 FHA 的活 性、离子交换层析和凝胶过滤层析的影响, 并与不 加脲的层析过程进行对比, 为百日咳疫苗的分离纯 化和层析工艺优化提供指导。
[2]

S-200(美国 GE 公司), 其他试剂均为国产分析纯 试剂, 所用纯水由 Q-plus 超纯水机制备(Millipore, 美国)。 酶标仪 550(美国 Bio-Rad 公司), Hofer miniVE 电泳仪(美国 GE 公司), AllegraTM 21R Centrifuge(美 国 BACKMAN COULTER 公司), AKTA Explorer 层 析设备(美国 GE 公司), 常压层析泵 PERISTALTIC PUMP P-1 和 常 压 层 析 检 测 器 SINGLE PATH MONITOR UV-1(美国 GE 公司), 层析柱(上海锦华 层析设备厂)。

1.2 实验方法 1.2.1 配置不同脲浓度的百日咳细胞培养上清液
在 8 支编号为 0~7 的 1.5 mL 离心管内分别加入 100 μL 细胞培养上清, 按顺序分别加入 900、775、 650、575、400、275、150 和 25 μL 的纯水, 然后分 别加入 0、125、250、375、500、625、750 和 875 μL 浓度为 8 mol/L 的脲溶液, 混合均匀, 最终得到脲浓 度分别为 0、1、2、3、4、5、6 和 7 mol/L 的细胞培 养上清。 1.2.2

硫酸铵沉淀
取适量 CCS, 磁力搅拌的条件下缓慢加入固体

硫酸铵至 20%(W/V, %)的终浓度, 待硫酸铵完全溶 解后, 调节体系的 pH 值到 7.0, 室温下继续搅拌 4 h, 离心(10 000 g, 20oC, 30 min)取沉淀, 用 1 mol/L 的 NaCl 将沉淀溶解。 1.2.3

离子交换层析
取硫酸铵沉淀的溶解液进行透析(透析袋截留

分子量为 8 000~10 000, Spectrum Medical Industries Inc, USA), 透析液为 25 mmol/L PB, pH 8.0。透析完 全后调节 pH 值到 6.0, 离心取上清。CM 离子交换 柱用 50 mmol/L PB, pH 6.0 的缓冲液*衡后上样进 行离子交换层析, 接着继续用 50 mmol/L PB, pH 6.0 的 缓 冲 液 淋 洗 , 最 后 用 50 mmol/L PB+0.5mol/L NaCl, pH 8.0 的缓冲液洗脱。 加脲的层析过程所用透 析液和*衡缓冲液均为含 2 mol/L 脲的相应缓冲液。 1.2.4

1 材料与方法
1.1 材料与仪器 细胞培养上清(CCS)(华兰生物工程股份有限公

凝胶过滤层析
用 3 个柱床体积的 100 mmol/L PB+0.15 mol/L

司), 百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)标准品(英 国 NIBSC 公司), BSA(北京欣经科生物技术有限公 司), SDS-PAGE 低分子量电泳 Marker(中国科学院上 海 生 物 化 学 研 究 所 ), 离 子 交 换 层 析 介 质 CM Sepharose
TM

NaCl, pH 7.0 的缓冲液*衡层析柱, 280 nm 波长下监测 紫外吸收值, 取适量离子交换层析样品上柱, 用*衡缓 冲液继续洗脱, 收集紫外吸收峰对应的洗脱液, 流速 0.8 mL/min。 加脲的层析过程所用洗脱液为 100 mmol/L

FF 和 凝 胶 过 滤 层 析 介 质 Sephacryl

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PB+0.5 mol/L NaCl+2 mol/L Urea, pH 7.0。 1.2.5 1.2.6 PT 和 FHA 活性检测 PT 和 FHA 活性回收率采用 ELISA 法 [4]检测。

2.2

脲对离子交换层析的影响 在离子交换层析过程中加入 2 mol/L 脲, 并与不

加脲的层析过程进行对比。百日咳发酵液经 (NH4)2SO4 沉淀和透析处理后即可上样进行离子交换 层析。层析谱图如图 1 所示。从图 1 可以看出, 两次 层析的谱图形状基本一致, 但采用 2 mol/L 脲缓冲液 为流动相洗脱得到的洗脱峰(图 1-B Fraction B)的峰面 积比较大。 蛋白和活性回收率的分析结果如表 2 所示。
表2 脲对离子交换层析过程中的蛋白和活性回收率的 影响
Effect of urea on the recoveries of protein and activity in IEC
Protein recovery (%)c 100
a

蛋白质浓度检测
总蛋白浓度采用改良的 Bradford 法 测定, 根据
[5]

标准品 BSA 的标准曲线计算样品中总蛋白质含量。 1.2.7 PT 和 FHA 纯度检测 采用 SDS-PAGE 检测 PT 和 FHA 纯度, 分离胶 浓度为 15% , 银染法显色。
[6]

2 结果
2.1 不同浓度的脲对原料活性的影响 由于 PT 和 FHA 都具有较高的疏水性, 因此在

Table 2

Sample CCS 1 IE before

PT recovery (%)d 100 60.8±3.1 25.9±1.2 53.89±3.0 84.3±4.6 48.6±2.7 71.7±3.5

FHA recovery (%)e 100 8.5±0.9 36.7±1.9 50.2±2.2 51.0±2.5 20.9±1.1 56.0±2.0

低盐水溶液中不稳定, 容易形成聚集体。虽然 PT 和 FHA 在 高 盐 体 系 下 较 稳定 , 但 是 高 浓 度 NaCl(如 0.5~1.0 mol/L)的存在将导致原料液无法采用常规的 离子交换层析进行分离纯化。文献报道高浓度变性 剂 脲 容 易 导 致 蛋 白 的 变 性 [9], 但 在 合 适 的 浓 度 下 , 脲却可以提高 PT 的稳定性 。因此, 实验考察了不 同脲浓度对百日咳原料液活性的影响, 活性检测结 果如表 1 所示。
表1
Table 1
[3]

7.0±0.9 114.3±3.1 7.6±1.0 9.8±1.1 91.3±3.2 9.6±0.8

1 fraction A 1 fraction B 2 IE before
ab

2 fraction Ab 2 fraction B
b

脲浓度对原料中 PT 和 FHA 活性的影响
Effect of urea concentration on the activity of PT and FHA

a: IE before represents the dialysate (CCS followed by ammonium sulfate precipitation, dissolution and dialysation) loaded onto IEC column; b: the samples include 2 mol/L urea; c: the average protein recovery was calculated by tri-repeated experiment; d: the average PT recovery was calculated by tri-repeated experiment; e: the average FHA recovery was calculated by tri-repeated experiment

Sample S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7

Urea concentration (mol/L) 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

PT recovery (%)a 100 101.2±6.2 78.7±5.3 81.2±5.7 73.0±4.9 60.4±4.6 48.1±3.2 44.6±2.1

FHA recovery (%)b 100 84.1±3.5 112.1±5.2 74.4±2.8 84.3±4.9 69.9±3.6 66.6±3.9 21.4±3.3

表 2 中 IE before 百分数数值以 CCS 为参照, 各 峰的百分数数值以 IE before 为参照, 从中可以看出, 透析过程中, 在不加脲的情况下, PT 有 40%的活性 损失, FHA 有高达 90%左右的活性损失; 在加入 2 mol/L 脲的情况下, PT 只有 15%的活性损失, FHA 的 活性损失也降低到 50%左右。离子交换过程中, 2 mol/L 脲的加入将 PT 的活性回收率从 54%提高到 72%, FHA 的活性回收率从 50%提高到 56%。 综合考 虑透析和离子交换层析, 2 mol/L 脲的加入使 PT 的 活性回收率从 33%提高到 60%, FHA 的活性回收率 从 5%提高到 29%。 离子交换各个组分的 SDS-PAGE 分析结果如图 2 所示。从图中可以看出, 在不加脲的情况下, PT 和 FHA 混合组分的电泳条带在 60~90 kD 之间有一些 比较明显的杂带(Lane 5); 加入 2 mol/L 脲后发现, 杂蛋白的相对含量有所降低, 目标蛋白的纯度得到 进一步的提高(Lane 8)。
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a: the average PT recovery was calculated by tri-repeated experiment; b: the average FHA recovery was calculated by tri-repeated experiment

由表 1 可知, 随着脲浓度的增大(0~7.0 mol/L), PT 的活性回收率逐步从 100%降低到 44.6%, 而 FHA 的 活性则先增大到 112.1%后再逐步减小到 21.4%。脲浓 度在 2 mol/L 时, FHA 回收率达到最高值, 为 112%, 此 时的 PT 回收率也较高, 为 78%。因此本研究选用 2 mol/L 的脲浓度来考察脲对层析效果的影响。

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图1
Fig. 1

离子交换层析谱图(A: 不含脲, B: 含 2 mol/L 脲)

Elution profiles of ion-exchange chromatography(A: in the absence of urea, B: in the presence of 2 mol/L urea)

中可知, 2 mol/L 脲的加入, 明显提高了凝胶过滤层 析的蛋白和活性回收率。各洗脱峰累加的蛋白回收 率从 57.1%提高到 94.1%, PT 回收率从 25.3%提高到 90.4%, FHA 回收率从 60.6%提高到 119.2%。 此外, PT 和 FHA 的活性分别也更加集中, FHA 主要分布在第 一个洗脱峰中(图 3B, Fraction a), 而 PT 主要分布在 第二个洗脱峰中(图 3B, Fraction b), 取得了更好的 分离效果。
表3 图2 离子交换洗脱组分的 SDS-PAGE 电泳图 脲对凝胶过滤层析过程中的蛋白和活性回收率的 影响
Effect of urea on the recoveries of protein and activity in GFC
Protein Recovery (%)c 100 27.6±2.2 4.1±1.0 16.1±1.2 0 9.3±1.3 54.2±2.5 25.9±2.1 14.0±1.3 3.2±0.7 84.0±2.5 3.2±0.5 105.2±5.4 7.6±1.0 6.4±1.2 16.6±1.0 27.3±1.7 PT Recovery (%)d 100 2.8±0.5 5.9±1.2 FHA Recovery (%)e 100 20.2±1.9 13.1±1.1

Table 3

Fig. 2 SDS-PAGE analysis of PT and FHA eluted from IEC in the presence and absence of 2 mol/L urea in the elution buffer
1: CCS; 2: ASP-S; 3: IEb in the absence of 2 mol/L urea; 4: fraction A in the absence of 2 mol/L urea; 5: fraction B in the absence of 2 mol/L urea; 6: marker; 7: standard PT; 8: fraction B in the presence of 2 mol/L urea; 9: fraction A in the presence of 2 mol/L urea; 10: IEb in the presence of 2 mol/L urea

Sample GF beforea 1 fraction A 1 fraction B 1 fraction C 1 fraction D 1 fraction E 2 fraction Ab 2 fraction Bb 2 fraction C
b

2.3

脲对凝胶过滤层析的影响 取适量离子交换层析样品上柱, 用*衡缓冲

液洗脱, 收集紫外吸收峰对应的洗脱液, 流速 0.8 mL/min。不加脲的层析过程洗脱液为 100 mmol/L PB+0.15 mol/L NaCl, pH 7.0, 加脲的层析过程所用 洗脱液为 100 mmol/L PB+0.5 mol/L NaCl+2 mol/L urea, pH 7.0。层析谱图如图 3 所示。加脲与不加脲 的层析谱图存在明显的差异。2 mol/L 脲的加入, 明 显提高了洗脱峰(图 3B)的峰面积。提高了分离度(如 Fraction a 和 b), 洗脱峰的数目也从 5 个降低到 3 个。 蛋白和活性分析结果如表 3 所示。 表 3 各峰的百分数数值以 GF before 为参照, 从
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a: GF before represents the sample loaded onto GFC column; b: the samples include 2 mol/L urea; c: the average protein recovery was calculated by tri-repeated experiment; d: the average PT recovery was calculated by tri-repeated experiment; e: the average FHA recovery was calculated by tri-repeated experiment

凝胶过滤层析各个组分的 SDS-PAGE 分析结果 如图 4 所示。从图 4 可以看出, 在不加脲的情况下, PT 及其亚基在各个洗脱峰中均有一定的分布(Lanes 6~9), 不利于 PT 的回收, 而且相应的洗脱峰中还含

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图3
Fig. 3

凝胶过滤层析谱图(A: 不含脲, B: 含 2 mol/L 脲)

Elution profiles of gel filtration chromatography(A: in the absence of 2mol/L urea , B: in the presence of 2mol/L urea)

有少量的杂蛋白, 纯度有待于进一步提高。加入 2 mol/L 脲后, 凝胶过滤的分辨率得到进一步提高, 具有完整亚基结构的 PT 分布于 Fraction b 中, 只含 有部分亚基的 PT 分布于 Fraction c 中。

分别为 28 kD、23 kD、22 kD、11.7 kD、9.3 kD, 摩 尔比为 1:1:1:2:1, 其中 S2 与 S4, S3 与 S4 分别形成 了二聚体。PT 总分子量为 103~117 kD[7]。FHA 是分 子量约为 220 kD 的无毒丝状蛋白。 新鲜制备的 FHA 在 SDS-PAGE 中显示 3~4 条带, 分别为 230、140、 125 和 98 kD。随着储存时间的延长, 230 kD 的条带 会消失, 新出现 75 和 58 kD 的两条带 [8]。 针对百日咳疫苗在低盐条件下不稳定, 容易聚 集, 后续的分离纯化操作难以展开, 纯化效率低的 难题, 本文利用脲具有稳定 PT 和 FHA 结构的特点, 在整个层析过程中加入 2 mol/L 脲, 研究结果表明在 缓冲液中加入 2 mol/L 脲能显著提高透析、 离子交换 层析和凝胶过滤层析操作的效果。通过考察不同脲 浓度对原料活性的影响, 发现随着脲浓度的逐步增 加, PT 的活性回收率逐步降低, 而 FHA 的活性回收 率先增大后减小, 在 2 mol/L 的浓度时达到最大值。 在较低的脲浓度(如 2 mol/L)下, PT 和 FHA 的稳定性 但是, 得到提高, 有利于后续分离纯化操作的实施 [3]。 继续增加脲浓度将导致 PT 和 FHA 的变性和失活。 根据文献报道, 在 5 mol/L 脲溶液中放置 4 d, PT 将 降聚成 S-1, S-5 亚基, S-2 和 S-4 的二聚体, 以及 S-3 和 S-4 的二聚体; 在 8 mol/L 脲的条件下放置 16 h, PT 将降解为 5 个独立的亚基, 即 S-1、 S-2、 S-3、 S-4 透析过程中, 由于 2 mol/L 脲的加入, 避免 和 S-5[9]。 了盐浓度的降低导致的 PT 和 FHA 的聚集和沉淀, 提高了目标蛋白的活性回收率(表 1)。离子交换过程 中, 2 mol/L 脲的加入, 稳定了 PT 和 FHA 的结构, 抑 制了 PT 和琼脂糖基质的相互作用 [10], 将 PT 的活性
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图4

凝胶过滤洗脱组分的 SDS-PAGE 电泳图

Fig. 4 SDS-PAGE analysis of PT and FHA eluted from GFC in the presence and absence of 2 mol/L urea in the elution buffer
1,10: GF before; 2: fraction a in the presence of 2 mol/L urea; 3: fraction b in the presence of 2 mol/L urea; 4: marker; 5: fraction c in the presence of 2 mol/L urea; 6: fraction a in the absence of 2 mol/L urea; 7: fraction b in the absence of 2 mol/L urea; 8: fraction c in the absence of 2 mol/L urea; 9: fraction e in the absence of 2 mol/L urea

3 讨论
PT 和 FHA 是 APV 最重要的两种组分。PT 是 百日咳杆菌产生的一种主要的活性成分, 具有血凝 活性, 促使淋巴细胞增多, 对组织胺致敏, 增加胰 岛素活性等诸多生物学活性, 同时也是非常重要的 免疫原。PT 由 5 个亚基(S1-S5)构成。各亚基分子量

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回收率从 54%提高到 72%, FHA 的活性回收率从 50%提高到 56%, 提高了离子交换层析的分辨率和 目标蛋白的纯度。同样地, 在凝胶过滤层析中 2 mol/L 脲的加入, 提高了 PT 和 FHA 的活性回收以 及凝胶过滤层析的分辨率, PT 和 FHA 的活性分布更 加集中, FHA 主要分布在第一个洗脱峰中, 回收率 接* 100%, PT 主要分布在第二个洗脱峰中, 回收率 接* 85%。此外, SDS-PAGE 分析结果表明, 在缓冲 液中加入 2 mol/L 脲的凝胶过滤层析中, 使具有完整 亚基结构的 PT 和缺少部分亚基的 PT 得到了很好的 分离。在凝胶过滤层析各组份的电泳分析中, PT 和 FHA 各亚基形成的多聚体的分子量大小和凝胶过滤 蛋白洗脱峰大致吻合。 在缓冲液中加入 2 mol/L 脲的 凝胶过滤层析(图 3B)中, 第一个洗脱峰(图 4 Lane 2) 主要为 FHA 和 PT 的 S4、 亚基组成, 分子量较大, S5 由于原料中 FHA 含量较低, 我们只能看到 PT 亚基 的条带; 第二个洗脱峰(图 4 Lane 3)为完整亚基的 PT, 分子量次之; 第三个洗脱峰(图 4 Lane 5)为不完 整亚基的 PT, 分子量较小。在缓冲液中不含脲的凝 胶过滤层析(图 3A)中, 第一个洗脱峰(图 4 Lane 6)为 FHA 和 PT 部分亚基, 另外还有一些杂蛋白, 分子量 较大, 由于原料中 FHA 含量低, 导致洗脱峰中 FHA 浓度低于 PT 亚基; 第二个洗脱峰(图 4 Lane 7)为 FHA 和 PT 不完整亚基 S1 的结合体, 另外还有一些 杂蛋白, 分子量次之; 第三个洗脱峰(图 4 Lane 8)为 PT, 分子量较小; 第四个洗脱峰(图 4 Lane 9)为 PT 不完整亚基 S1、S3、S4, 分子量最小。 综上所述, 2 mol/L 脲的加入明显提高了 PT 和 FHA 的分离纯化效果, 采取两步层析的方法, PT 的 活性总回收率从 5.5%提高到 50.4%, FHA 的活性总 回收率从 1.0%提高到 30.5%。2 mol/L 脲的加入, 不 仅抑制由于较强的疏水性引起的蛋白聚集现象, 还 抑制了 PT 和琼脂糖基质的相互作用 [10], 从而提高 了层析效果和活性回收率。理论上, 2 mol/L 脲的加 入, 还可能会使包埋在分子内部的部分疏水性氨基 酸残基暴露出来, 导致蛋白质表面电荷分布和分子 结构的变化 [11], 从而引起蛋白质离子交换层析行为 和凝胶过滤层析行为的变化。 整个纯化过程(硫酸铵沉淀加两步层析)中,

PT 总回收率为 7.37%(不含脲)和 50.77%(含脲); FHA 总回收率为 1.42%(不含脲)和 28.56%(含脲)。

REFERENCES
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